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TRIzol是一种快捷方便的总RNA提取试剂，可以从动物组织、各种微生物及细胞等中提取总RNA。在样品处理过程中，TRIzol可完全充分裂解样品，同时保持RNA的完整性。加入氯仿离心后，溶液形成上清层(水相)、中间层和有机相(下层)。取出上清层，可用异丙醇沉淀回收RNA；中间层用乙醇沉淀回收DNA；有机相可用异丙醇沉淀回收蛋白。

TRIzol试剂可用于少量样品的RNA提取，也可用于大量样品的RNA提取。提取RNA整个过程方便快速，整个操作过程可一个小时内完成，提取的RNA无蛋白和DNA的污染，纯度髙，可直接用于Northern Blotting、斑点杂交、polyA筛选、mRNA纯化、体外翻译、RNase保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。

1. 实验过程中经常更换新手套，使用专用超净台，在操作过程中避免讲话；
   
2. 应尽量使用无RNase的实验器材；枪头、塑料制品和玻璃制品可以用0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理过夜，然后在120℃下高压灭菌30min以去除残留的DEPC。玻璃制品也可用干热灭菌去除RNase(180℃烘烤2h)；
   
3. 配制溶液应使用无RNase水(无RNase水的配制方法：双蒸水加入DEPC至终浓度0.01％ V/V，放置过夜，然后120℃下高压灭菌30min，备用)；
   
4. 整个实验过程中使用的试剂，实验器材和无RNase水应专用，避免交叉污染。
   
5. 本试剂含强变性剂，应避免与皮肤接触，如接触皮肤，应立即用大量的水冲洗，根据需要情况到医院处理。本品含有酚类、巯基乙醇等成分，具有特殊气味，请于吸取试剂溶液后马上盖好瓶盖，或于通风橱中操作。

1. 样品处理
   
   1. 贴壁培养细胞
      ① 倒净培养液；
      ② 每10cm2生长的培养细胞中加入1mL百奥莱博TRIzol试剂，在室温下水平放置5min，使裂解液均匀分布于细胞表面，然后用移液枪吹打细胞使细胞脱落；
      ③ 将细胞裂解液转移至离心管中，并用1mL枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
      
   2. 悬浮培养细胞
      ① 直接离心收集细胞，倒净培养液；
      ② 细胞沉淀中每5～10×10⁶细胞加入1mL百奥莱博TRIzol试剂；
      ③ 将细胞裂解液转移至离心管中，并用1mL枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
      
   3. 动、植物组织材料
      ① 将组织在液氮中磨碎成粉末状(应无明显颗粒)；
      ② 每50～100mg的组织加1mL百奥莱博TRIzol试剂，样品的体积不应超过TRIzol试剂体积的10％，并用匀浆器进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状；
      ③ 将细胞裂解液转移至离心管中，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
      ④ 12000g，4℃离心10min，然后小心吸取上清液，移入新的离心管中；
2. 向上述步骤1得到的裂解液中加入氯仿(每使用1mL百奥莱博TRIzol加0.2mL氯仿)，盖紧离心管管盖，用手上下振荡15s(请勿涡漩激烈振荡请勿涡漩激烈振荡)，得桔红色浑浊液，无分层现象，室温静置3min；
   
3. 12000g，4℃离心15min；
   
4. 取出离心管，样品分为三层：黄色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。小心吸取黄色上清水相移至另一离心管，水相的体积约为所用百奥莱博TRIzol试剂的60％；
   
5. 向步骤4得到的上清水相加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min；
   
6. 12000g，4℃离心10min；
   
7. 小心去除上清，缓慢沿管壁加入1mL75％的乙醇(用DEPC处理过的水配制)，轻轻混匀。每使用1mL TRIzol
   试剂至少加1mL 75％的乙醇；
   
8. 12000g，4℃离心10min；
   
9. 小心吸尽上清；
   
10. 室温干燥沉淀2～5min(不可晾得太干，否则RNA将会很难溶解)，加入30～50μL的无RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-70℃保存。取RNA样品用1×TE Buffer(见备注)稀释样品100倍或适当的倍数，测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量。
    RNA的浓度＝OD₂₆₀×稀释倍数×0.04μg/μL，OD_260/280在1.8～2.1视为抽提的RNA的纯度很高。

1. 产率低
   
   1. 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足5分钟。
      严格按照说明书操作。
      
   2. RNA不完全溶解。
      缩短晾干时间。
      
   3. 三相分离时，吸取上清液不完全。
      尽量回收上清液
2. A260/A280＜1.65
   
   1. 测定OD值时用的是水溶液。
      更换测定OD值时的溶液，用TE Buffer。
      
   2. TRIzol加量太少，造成蛋白质变性不充分。
      严格按照说明书操作。
      
   3. 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足5分钟。
      严格按照说明书操作。
      
   4. RNA不完全溶解。
      缩短晾干时间。
      
   5. 三相分离后，吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。
      小心吸取上清
3. RNA降解
   
   1. 使用的组织材料不够新鲜。
      提取RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料，或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存。
      
   2. 细胞用胰酶消化。
      不要用胰酶消化细胞。
      
   3. 提取RNA时使用的试剂及器材中有RNase污染。
      做好试验前的准备工作，保证无RNase污染。
      
   4. 提取的组织材料中含有大量的RNase。
      加大TRIzol的用量
4. DNA污染
   
   1. 裂解组织或细胞使用的TRIzol量偏少。
      加大TRIzol的用量。
      
   2. 使用的组织材料中含有大量的有机溶剂(如：乙醇、异丙醇等)、高浓度的Buffer、碱性溶剂等。
      用DEPC水充分洗涤组织
5. 多糖的污染
   
   1. 多糖的理化学性质与RNA十分接近，因此很难将其从RNA中除去。
      加大TRIzol的用量。
   
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